ten główna różnica między ekstrakcją DNA i RNA jest to, że poziom pH Ekstrakcja DNA to pH 8, podczas gdy poziom pH ekstrakcji RNA to pH 4,7. DNA ma tendencję do denaturacji i przejścia do fazy organicznej przy kwaśnym pH. W alkalicznym pH RNA ulega hydrolizie alkalicznej ze względu na obecność 2' OH w cukrze rybozy.

Ekstrakcja DNA i RNA to dwie procedury zaangażowane w izolację i oczyszczanie kwasów nukleinowych z komórek tkanek. Obie procedury składają się z trzech kroków. Dobrej jakości DNA i RNA odgrywają kluczową rolę w eksperymentach z zakresu biologii molekularnej, biotechnologii, genomiki i epidemiologii.

Kluczowe obszary objęte

1. Co to jest ekstrakcja DNA? – Definicja, procedura 2. Co to jest ekstrakcja RNA? – Definicja, procedura 3. Jakie są podobieństwa między ekstrakcją DNA i RNA? – Zarys wspólnych cech 4. Jaka jest różnica między ekstrakcją DNA a RNA? – Porównanie kluczowych różnic

Kluczowe terminy: liza komórkowa, denaturacja białek, ekstrakcja DNA, pH, strącanie, ekstrakcja RNA

Co to jest ekstrakcja DNA?

Ekstrakcja DNA to procedura izolacji i oczyszczania DNA. DNA można wyizolować z krwi, zamrożonych próbek tkanek lub bloczków parafinowych. Trzy etapy ekstrakcji DNA to liza komórek, izolacja DNA i precypitacja. Podczas lizy komórki bariery błony komórkowej, takie jak błona komórkowa i błony jądra komórkowego, pękają w celu odsłonięcia DNA. Kolejnym krokiem jest usunięcie lipidów błonowych z próbki. Wreszcie, precypitacja DNA obejmuje usuwanie białek związanych z DNA przez proteazę i usuwanie RNA przez RNazę.

Rysunek 1: Procedura ekstrakcji DNA

Podstawowe protokoły ekstrakcji DNA

Poniżej przedstawiono podstawowe protokoły ekstrakcji DNA.

1. Liza komórek za pomocą buforu do lizy komórek w celu lizy błon komórkowych

2. Lipidy są rozkładane za pomocą detergentów i środków powierzchniowo czynnych

3. Trawienie białek przez dodanie proteazy

4. Trawienie RNA przez dodanie RNazy

5. Oddzielenie resztek komórek, strawionych białek, lipidów i RNA przez dodanie stężonej soli, a następnie odwirowanie

6. Precypitacja DNA etanolem za pomocą lodowatego etanolu lub izopropanolu. Siłę jonową octanu sodu można wykorzystać do poprawy strącania. Wytrącony DNA pojawia się jako nici w ostatecznym roztworze.

Rysunek 2: Ekstrahowany DNA

Do oddzielenia DNA od białek można również zastosować ekstrakcję fenolowo-chloroformową. Tutaj fenol denaturuje białka w próbce, a DNA pozostaje w fazie wodnej pod koniec ekstrakcji. A w fazie organicznej można znaleźć zdenaturowane białka. Inną metodą ekstrakcji DNA jest oczyszczanie minikolumny. Tutaj wiązanie DNA do kolumny zależy od pH i stężenia soli w buforze.

Co to jest ekstrakcja RNA

Ekstrakcja RNA odnosi się do procesu oczyszczania RNA z próbek. Konwencjonalna metoda ekstrakcji RNA nazywa się ekstrakcja tiocyjanianem guanidyniowo-fenolowo-chloroformowym. Tiocyjanian guanidyny denaturuje białka. Ponadto zaburza wiązania wodorowe cząsteczek wody i służy jako czynnik chaotropowy. Do ekstrakcji RNA używany jest specjalny odczynnik zwany Trójodczynnik. Zawiera tiocyjanian guanidyny, fenol i octan sodu. Cel podstawowych etapów ekstrakcji RNA jest podobny do celu ekstrakcji DNA. Poniżej opisano protokół ekstrakcji RNA.

1. Komórki przemywa się lodowatym PBS w celu utrzymania osmolarności komórek.

2. Zaaspiruj komórki i zhomogenizuj próbkę za pomocą odczynnika Tri.

3. Dodaj chloroform i wstrząśnij.

4. Odwirowanie może skutkować powstaniem trzech warstw. Górna warstwa to warstwa wodna, która jest przezroczysta. Warstwa środkowa lub interfaza zawiera wytrącony DNA. Dolna warstwa to warstwa organiczna, która jest różowa.

5. Usuń warstwę wodną i dodaj izopropanol. Wirowanie może spowodować powstanie peletu.

6. Przemyj osad 75% etanolem. Wysuszyć pelet na powietrzu.

7. Rozpuść osad w buforze TE lub wodzie.

Rysunek 3: Ekstrakcja RNA fenolowo-chloroformowa

Ekstrakcję RNA na ogół przeprowadza się przy pH poniżej 7. W alkalicznym pH RNA jest bardziej podatny na degradację przez alkaliczną hydrolizę ze względu na obecność grupy OH w pozycji 2′ cukru rybozy. Ponadto RNA ma tendencję do pozostawania w fazie wodnej przy kwaśnym pH. Z drugiej strony DNA ma tendencję do denaturacji i przechodzenia do fazy organicznej przy kwaśnym pH. Dlatego ekstrakcję DNA można przeprowadzić przy pH około 8. DNA składa się z cukru dezoksyrybozy i nie podlega hydrolizie alkalicznej.

Podobieństwa między ekstrakcją DNA i RNA

Różnica między ekstrakcją DNA i RNA

Definicja

Ekstrakcja DNA: Procedura izolacji i oczyszczania DNA

Ekstrakcja RNA: Proces oczyszczania RNA z próbek

Rodzaj wyekstrahowanego kwasu nukleinowego

Ekstrakcja DNA: DNA

Ekstrakcja RNA: RNA

pH

Ekstrakcja DNA: Sporządzono o 8

Ekstrakcja RNA: Zrobione o 4,7

Kroki

Ekstrakcja DNA: Rozerwanie błon komórkowych lub liza komórek, usunięcie lipidów błonowych i wytrącenie DNA

Ekstrakcja RNA: Liza komórkowa, ekstrakcja tiocyjanianem guanidyny-fenol-chloroform, przygotowanie izopropanolem

Stosowanie wody uzdatnionej DEPC

Ekstrakcja DNA: Nic

Ekstrakcja RNA: Wszystkie odczynniki są przygotowywane z wodą oczyszczoną DEPC

Składowanie

Ekstrakcja DNA: DNA można wyekstrahować wcześniej i przechowywać w partiach

Ekstrakcja RNA: Ekstrakcja RNA odbywa się tuż przed dalszymi procedurami

Przechowywanie długoterminowe

Ekstrakcja DNA: W temperaturze -20 °C

Ekstrakcja RNA: W temperaturze -80 °C

Wniosek

Ekstrakcję DNA przeprowadza się przy pH 8. DNA ma tendencję do przechodzenia do fazy organicznej, ponieważ ulega denaturacji w kwaśnym pH. Jednak ekstrakcję RNA przeprowadza się przy niskim pH, aby zapobiec degradacji przez hydrolizę alkaliczną. Podstawowy cel etapów ekstrakcji DNA i RNA jest podobny. Główną różnicą między ekstrakcją DNA i RNA są warunki pH stosowane w każdym rodzaju ekstrakcji.

Referencja:

1. „Podstawy ekstrakcji DNA”. Wirtualny podręcznik Alaska BioPREP, Alaska BioPREP University of Alaska Fairbanks, dostępny tutaj2. „Protokół izolacji RNA i odwrotnej transkrypcji: komórki w hodowli”. abcam, dostępne tutaj

Zdjęcie dzięki uprzejmości:

1. „Rysunek 17 01 02” Autor: CNX OpenStax – (CC BY 4.0) przez Commons Wikimedia 2. „Ekstrakcja DNA” Joo Nath – Praca własna (CC BY-SA 4.0) przez Commons Wikimedia 3. „Ekstrakcja PhOH-CHCl3” Squidonius (dyskusja) – Praca własna (oryginalny tekst: self-made) (domena publiczna) przez Commons Wikimedia