ten główna różnica między GFP a EGFP jest to, że GFP (skrót od Green Fluorescent Protein) to białko, które wykazuje jasnozieloną fluorescencję pod wpływem światła niebieskiego, podczas gdy EGFP (skrót od Enhanced Green Fluorescent Protein) wykazuje silniejszą fluorescencję niż GFP. Ponadto inną ważną różnicą między GFP a EGFP jest to, że GFP jest białkiem typu dzikiego wyizolowanym z meduzy Aequorea victoria. Ale EGFP jest zmodyfikowanym wariantem oryginalnego typu dzikiego.

GFP i EGFP to dwa rodzaje białek, które służą jako wewnętrzne chromofory. Nie wymagają żadnych pomocniczych enzymów/substratów, kofaktorów ani produktów genów, aby wykazywać swój kolor. Dlatego oba są wykorzystywane jako reporter ekspresji genów w biologii molekularnej.

Chromofor, EGFP, GFP, zielona fluorescencja, białko typu dzikiego

Co to jest GFP

GFP (zielone białko fluorescencyjne) to białko, które świeci na zielono w świetle niebieskim lub UV. Naturalnie występuje w meduzie Aequorea Victoria. GFP składa się z 238 aminokwasów. Wielkość GFP to 26,9 kDa. GFP jest potężnym narzędziem w biologii molekularnej ze względu na swoją wewnętrzną fluorescencję bez żadnej cząsteczki pomocniczej. Fluorescencja wynika z kowalencyjnego przegrupowania sąsiadujących aminokwasów białka. Po sfałdowaniu białka, główne atomy łańcucha, Ser65, Tyr66 i Gly67 tworzą wysoce sprzężony, planarny chromofor p-hydroksybenzylidenoimidazolinonu w obecności O₂. Badania struktury krystalicznej ujawniają, że upakowanie chromoforu w rdzeniu struktury β-beczkowej cząsteczki chroni ją przed wygaszeniem przez tlen paramagnetyczny, dipole wody czy izomeryzację cis-trans. Ponadto niekowalencyjne oddziaływania chromoforu z sąsiednimi cząsteczkami wzmacniają jego właściwości spektralne.

Rysunek 1: Reprezentacja wstążkowa GFP i fluoroforu

GFP można wprowadzić do organizmu podczas transgenicznych modyfikacji. Może być również utrzymywany przez pokolenia. Główną wadą GFP typu dzikiego jest zmniejszona skuteczność białka w obrazowaniu komórek, spowodowana niską wydajnością fałdowania w temperaturach fizjologicznych, takich jak 37°C, co powoduje spadek sygnału fluorescencyjnego. Ponadto tempo dojrzewania GFP w komórce gospodarza jest powolne przy tendencji do agregacji. Można zaobserwować dwa piki wzbudzenia ze względu na obecność dwóch różnych postaci chromoforu. Jednak inżynieria białek rozwiązała większość problemów, wprowadzając wariantowe formy GFP typu dzikiego.

Co to jest EGFP

EGFP (białko o zwiększonej zielonej fluorescencji) jest wariantem GFP typu dzikiego o wyższej intensywności emisji w stosunku do GFP. Jest to jeden z pierwszych i najważniejszych wariantów GFP. Dwie mutacje, F64L i S65T, generują EGFP z większą wydajnością fałdowania w 37 °C. Co ciekawe, EGFP ma pojedynczy pik wzbudzenia przy ~490 nm z powodu tłumienia piku 395 nm przez S65T, ponieważ moduluje on zjonizowany stan Glu222 w pobliżu. Z drugiej strony F64L zwiększa wydajność składania w 37 °C. Co ważne, sekwencja kodonów EGFP jest zoptymalizowana pod kątem ekspresji w komórkach ssaków.

Rysunek 2: Ekspresja EGFP

Podobieństwa między GFP a EGFP

Różnica między GFP a EGFP

Definicja

GFP: Białko typu dzikiego, które wykazuje zieloną fluorescencję w świetle niebieskim lub UV i naturalnie występuje w meduzie, Aequorea Victoria

EGFP: Wariant GFP typu dzikiego o wyższej intensywności emisji w stosunku do GFP

Oznacza

GFP: Białko zielonej fluorescencji

EGFP: Wzmocnione białko zielonej fluorescencji

Początek

GFP: Typ dziki

EGFP: Mutant

64^NS Aminokwas

GFP: Fenyloalanina

EGFP: Leucyna

65^NS Aminokwas

GFP: Serine

EGFP: Treonina

Jasność koloru

GFP: Jasno zielony

EGFP: Jaśniejszy zielony

Szczyty wzbudzenia

GFP: Dwa piki (395 nm i 490 nm)

EGFP: Pojedynczy pik (490 nm)

Wydajność składania w temperaturze 37 °C

GFP: Niski

EGFP: Wysoka

Wniosek

GFP to białko typu dzikiego, które wykazuje jasnozieloną fluorescencję pod wpływem światła niebieskiego lub UV. EGFP jest odmianą GFP, która wykazuje większą intensywność fluorescencji w porównaniu z GFP. Zatem główną różnicą między GFP a EGFP jest intensywność zielonej fluorescencji emitowanej przez każde białko.

Referencja:

1. Arpino, James A.J., et al. „Struktura krystaliczna ulepszonego zielonego białka fluorescencyjnego do rozdzielczości 1,35 Å ujawnia alternatywne konformacje dla Glu222”. PLOS Medicine, Public Library of Science, journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0047132.

Zdjęcie dzięki uprzejmości:

1. „Gfp i fluorofor” Raymond Keller (Raymond Keller (wykład)), pod auspicjami Crystal Protein. – Praca własna (domena publiczna) za pośrednictwem Commons Wikimedia 2. „Fgams ppat egfp puncta” Zhao A, Tsechansky M, Swaminathan J, Cook L, Ellington AD, et al. (2013) Przejściowo transfekowane biosyntetyczne enzymy purynowe tworzą ciała stresowe. PLoS ONE 8(2): e56203. doi:10.1371/journal.pone.0056203 (CC BY 3.0) przez Commons Wikimedia