Główna różnica – PCR vs QPCR

PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) i qPCR (ilościowa reakcja PCR) to dwie techniki stosowane w biotechnologii do amplifikacji DNA do różnych celów. PCR to stosunkowo prosta technika. qPCR jest również znany jako PCR w czasie rzeczywistym lub cyfrowy PCR. ten główna różnica między PCR i qPCR jest to, że PCR jest techniką jakościową, podczas gdy qPCR jest techniką ilościową. PCR umożliwia odczytanie wyniku jako „obecność lub nieobecność”. Ale w qPCR, ilość DNA amplifikowanego w każdym cyklu jest określana ilościowo. Jeśli RNA jest używane w PCR, technika jest znana jako RT-PCR (PCR z odwrotną transkrypcją), a jeśli RNA jest używane w qPCR, technika jest znana jako qRT-PC.

Kluczowe obszary objęte

1. Co to jest PCR – Definicja, procesy, zastosowania 2. Co to jest QPCR – Definicja, procesy, zastosowania 3. Jakie są podobieństwa między PCR a QPCR – Zarys wspólnych cech 4. Jaka jest różnica między PCR a QPCR? – Porównanie kluczowych różnic

Kluczowe warunki: elektroforeza w żelu agarozowym, amplikony, polimeraza DNA, barwnik fluorescencyjny, PCR, sondy, qPCR, RT-qPCR

Co to jest PCR

PCR odnosi się do techniki w biotechnologii, która umożliwia analizę krótkiej sekwencji DNA poprzez amplifikację wybranego segmentu DNA. Jest to stosunkowo czuła metoda, ponieważ jedna reakcja wymaga bardzo małych objętości. Technika ta opiera się na zdolności polimerazy DNA do syntezy nowych nici DNA z oferowaną nicią matrycową w sposób komplementarny. Mieszanina reakcyjna PCR składa się z polimerazy DNA, nukleotydów DNA, starterów, matrycy DNA do amplifikacji i magnezu. Wzmocnienie odbywa się wewnątrz termocyklera. Polimeraza DNA powinna być odporna na ciepło, ponieważ w tej reakcji stosuje się wysokie temperatury. Dwa typy polimeraz DNA stosowane w PCR to polimeraza Taq DNA i polimeraza DNA Pfu. Polimeraza Taq DNA jest szeroko stosowana w PCR.

Polimeraza DNA wymaga wcześniej istniejącej nici DNA na końcu 3', aby zsyntetyzować nową nić. Stąd do mieszaniny reakcyjnej dodawany jest starter oligonukleotydowy w celu rozpoczęcia syntezy DNA. Wymóg startera w PCR pozwala na amplifikację tylko określonego regionu w matrycy. Sekwencja docelowa jest oflankowana przez startery do przodu i do tyłu. Pod koniec PCR powstają nowe kopie określonej sekwencji DNA, które nazywane są amplikony, gromadzone są w miliardach. Składniki PCR powinny być zoptymalizowane w taki sposób, aby poprawić wydajność PCR, jednocześnie minimalizując niepowodzenie. Standardową reakcję PCR pokazano na rycinie 1.

Rysunek 1: PCR

Etapy PCR

Poniżej opisano trzy etapy PCR.

1. Denaturacja – Dwuniciowa matryca DNA jest rozdzielana na dwie pojedyncze nici przez podgrzanie do 94-95°C.
2. Wyżarzanie – Startery przedni i wsteczny wiążą się z sekwencjami komplementarnymi w matrycy. Temperatura zależy od temperatury topnienia kombinacji podkładów.
3. Rozszerzenie podkładu – enzym polimeraza DNA wydłuża każdy starter na ich 3’końcu poprzez dodanie komplementarnych zasad do rosnącej nici. Optymalną temperaturę polimerazy Taq, tj. 72°C, stosuje się jako temperaturę w etapie wydłużania. Czas wydłużania zależy od liczby par zasad w nici wzorcowej.

Trzy kroki są powtarzane 28-35 razy. Elektroforeza w żelu agarozowym jest stosowana do frakcjonowania pod względem wielkości produktów PCR. Produkt jest barwiony bromkiem etydyny i jest obserwowany w świetle UV. Produkt PCR lub zamplifikowany DNA można wykorzystać do klonowania, sekwencjonowania lub genotypowania.

Co to jest QPCR

QPCR odnosi się do techniki w biotechnologii, która umożliwia wykrywanie, charakteryzowanie i oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych do różnych zastosowań. Jest to więc rodzaj ilościowego PCR. Jako qPCR można stosować zarówno DNA, jak i RNA. Jeśli jako matrycę stosuje się RNA, należy najpierw poddać go odwrotnej transkrypcji na cDNA. Dlatego ten typ qPCR jest znany jako RT-qPCR. Tradycyjną reakcję PCR przeprowadza się dla cDNA lub zwykłej próbki DNA. Jednak w qPCR do znakowania produktu PCR na każdym etapie cyklu PCR stosuje się barwniki fluorescencyjne. Umożliwia to zbieranie danych w miarę postępu PCR, co pozwala na ilościowe oznaczenie amplikonów podczas wykładniczej fazy PCR. Głównym rodzajem barwnika stosowanego w qPCR jest SYBR Green. Barwnik wiąże się z dwuniciowym DNA. Ponieważ fluorescencja wzrasta proporcjonalnie do ilości amplifikowanego DNA, kwantyfikację można przeprowadzić w „czasie rzeczywistym”. Główną wadą stosowania barwnika jest to, że pozwala on na oznaczenie ilościowe jednego konkretnego produktu w próbce. Oprócz barwników w procesie oznaczania ilościowego można również stosować sondy. Sondy TaqMan są jednym z głównych typów sond oligonukleotydowych stosowanych w qPCR, a proces emisji fluorescencji przedstawiono na rycinie 2.

Rysunek 2: Sonda TaqMan

Sondy można zaprojektować w taki sposób, aby wykrywały kilka produktów PCR w tej samej próbce. Sonda TaqMan jest jednym z głównych typów sond do hydrolizy; włączenie tej sondy do produktu PCR odsłania fluorofor emitujący fluorescencję. Barwniki fluorescencyjne są bardziej specyficzne dla produktu PCR. Dlatego są używane w większości testów diagnostycznych do wykrywania produktu PCR.

Podobieństwa między PCR a QPCR

Różnica między PCR a QPCR

Definicja

PCR: PCR to technika w biotechnologii, która umożliwia analizę krótkiej sekwencji DNA poprzez amplifikację wybranego segmentu DNA.

QPCR: QPCR to technika w biotechnologii, która umożliwia wykrywanie, charakteryzowanie i oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych do różnych zastosowań.

Ilościowe/jakościowe

PCR: PCR jest techniką jakościową.

QPCR: QPCR jest techniką ilościową.

Wykrywanie produktu

PCR: Produkt jest wykrywany przez elektroforezę w żelu agarozowym w reakcji PCR.

QPCR: Produkt można wykryć w każdym cyklu amplifikacji w qPCR.

Kolekcja danych

PCR: Dane są zbierane pod koniec reakcji w PCR.

QPCR: Dane zbierane są podczas wykładniczej fazy reakcji w qPCR.

Rezolucja

PCR: PCR ma bardzo słabą rozdzielczość.

QPCR: QPCR ma bardzo wysoką rozdzielczość.

Barwniki

PCR: PCR wykorzystuje bromek etydyny do barwienia produktu podczas PCR.

QPCR: QPCR wykorzystuje barwniki fluorescencyjne do wykrywania produktu.

Czas

PCR: PCR jest bardziej czasochłonną metodą.

QPCR: QPCR jest mniej czasochłonny.

RNA

PCR: RT-PCR to rodzaj PCR, który wykorzystuje RNA jako matrycę.

QPCR: RT-qPCR to rodzaj qPCR, który wykorzystuje RNA jako matrycę.

Rola

PCR: PCR służy do wykrywania obecności lub nieobecności niektórych fragmentów genomowych.

QPCR: QPCR służy do ilościowego oznaczenia konkretnego fragmentu w próbce.

Wniosek

PCR i qPCR to dwa rodzaje technik stosowanych w biotechnologii do amplifikacji DNA do różnych celów. PCR to tradycyjna metoda amplifikacji stosowana do identyfikacji obecności lub nieobecności fragmentu DNA. QPCR służy do ilościowego określenia konkretnego fragmentu w próbce. Zatem PCR jest techniką jakościową, podczas gdy qPCR jest techniką ilościową. To główna różnica między PCR a qPCR.

Referencja:

1. „QPCR vs. cyfrowy PCR vs. tradycyjny PCR”. Thermo Fisher Scientific, dostępne tutaj.

Zdjęcie dzięki uprzejmości:

1. „PCR” autorstwa Madprime – Praca własna (CC BY-SA 3.0) za pośrednictwem Commons Wikimedia2. „Taqman” Autor: Braindamaged - Praca własna oryginalnego przesyłającego (domena publiczna) za pośrednictwem Commons Wikimedia