Główna różnica – PCR vs RT-PCR

PCR i RT-PCR to dwie ważne techniki w biologii molekularnej. PCR został opracowany przez Kary Mullisa w latach 80-tych. Jest w stanie zwiększyć liczbę kopii danego genu w sposób wykładniczy, ułatwiając wykrycie tego konkretnego fragmentu DNA. Polimeraza Taq jest enzymem najczęściej używanym w systemach PCR. Jest to enzym termostabilny. W RT-PCR po odwrotnej transkrypcji następuje PCR. Enzym, odwrotna transkryptaza, bierze udział w syntezie komplementarnego DNA z RNA. ten główna różnica między PCR i RT-PCR jest to, że PCR wykorzystuje dwuniciowy DNA jako matrycę, podczas gdy RT-PCR wykorzystuje RNA jako matrycę.

Kluczowe obszary objęte

1. Co to jest PCR – Definicja, proces, zastosowanie 2. Co to jest RT PCR? – Definicja, cechy, zastosowanie 3. Jaka jest różnica między PCR a RT PCR? – Porównanie kluczowych różnic

Kluczowe terminy: PCR, RT-PCR, reakcja łańcuchowa polimerazy, reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją, matryca DNA, polimeraza DNA, denaturacja, annealing, przedłużanie startera

Co to jest PCR

PCR (Reakcja łańcuchowa polimerazy) jest metodą stosunkowo prostą, ale rewolucyjną. PCR wykorzystuje zdolność enzymu, polimerazy DNA, do syntezy nowych nici DNA w sposób komplementarny do oferowanej nici matrycowej. PCR jest nieodzowną techniką stosowaną zarówno w laboratoriach klinicznych, jak i badawczych do funkcjonalnej analizy genów, diagnozowania i monitorowania chorób dziedzicznych, klonowania DNA, sekwencjonowania i amplifikacji starożytnego DNA. Matryca DNA, nukleotydy, startery i polimeraza DNA to cztery główne składniki PCR. ten Szablon DNA jest zwykle dwuniciowym DNA z sekwencją docelową, która ma być amplifikowana. Polimeraza DNA Taq który jest wyizolowany z Thermus aquatics jest powszechnie stosowany w PCR. ten Polimeraza DNA Pfu to inny rodzaj polimerazy DNA o wysokiej wierności. Zarówno polimerazy Taq, jak i Pfu są odporne na ciepło. Nukleotydy dodane przez polimerazy DNA to adenina (A), guanina (G), cytozyna (C) i tymina (T). Ponieważ polimeraza DNA może tylko dodać nowy nukleotyd do końca 3' istniejącej nici DNA, starter oligonukleotydowy jest wymagany do rozpoczęcia syntezy DNA. Wymóg startera w PCR pozwala na wytyczenie tylko określonego regionu w matrycy. Sekwencja docelowa jest oflankowana przez startery do przodu i do tyłu. Pod koniec PCR nowe kopie zwane amplikonami określonej sekwencji DNA gromadzą się w miliardach. Składniki PCR powinny być zoptymalizowane w taki sposób, aby poprawić wydajność PCR, jednocześnie minimalizując niepowodzenie.

PCR to zautomatyzowany proces wykonywany przez termocyklery, które są w stanie przełączać się między różnymi temperaturami. PCR to trzyetapowy proces.

1. Denaturacja – Dwuniciowa matryca DNA jest rozdzielana na dwie pojedyncze nici przez podgrzanie do 94-95°C.
2. Wyżarzanie – Startery do przodu i do tyłu wiążą się z sekwencjami komplementarnymi w matrycy. Temperatura tego etapu zależy od temperatury topnienia kombinacji podkładów.
3. Rozszerzenie podkładu – enzym polimeraza DNA wydłuża każdy ze starterów na ich końcu 3’ poprzez dodanie komplementarnych zasad do rosnącej nici. Jako temperaturę w etapie wydłużania stosuje się optymalną temperaturę polimerazy Taq, 72°C. Czas wydłużania zależy od liczby par zasad w nici wzorcowej.

Trzy kroki są powtarzane 28-35 razy.

Rysunek 1: Reakcja łańcuchowa polimerazy

Produkty PCR frakcjonuje się pod względem wielkości za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym w porównaniu z drabinką DNA. Wizualizację DNA na żelu agarozowym wykonuje się przez barwienie bromkiem etydyny i obserwację pod UV. Zamplifikowane prążki DNA w UV w żelu barwionym bromkiem etydyny pokazano na figurze 2. Drabinka DNA jest pokazana w dołku najbardziej po lewej stronie.

Rysunek 2: prążki DNA

Co to jest RT-PCR

RT-PCR (Reakcja łańcuchowa polimerazy z odwrotną transkrypcją) jest jedną z najczulszych technik stosowanych do wykrywania mRNA. RNA jest odpowiednią matrycą do zbierania informacji na temat ekspresji genów w normalnej tkance lub ekspresji genów w zakażonej tkance. Matrycą do RT-PCR może być odpowiednio całkowity RNA lub wirusowy lub bakteryjny RNA. RNA podlega odwrotnej transkrypcji do komplementarnego DNA (cDNA) przez enzym odwrotną transkryptazę. Optymalna temperatura odwrotnej transkryptazy wynosi 46°C. cDNA jest używany w reakcji PCR w celu uzyskania produktu. Etapy reakcji PCR z odwrotną transkrypcją przedstawiono na figurze 3.

Rysunek 3: RT-PCR

RT-PCR można przeprowadzić w reakcjach dwuetapowych lub jednoetapowych. W reakcji dwuetapowej odwrotną transkrypcję i PCR przeprowadza się w dwóch oddzielnych etapach. W jednoetapowej RT-PCR, po odwrotnej transkrypcji następuje sekwencyjna reakcja PCR w jednej probówce. Zarówno cDNA, jak i końcowy produkt PCR można analizować w żelu agarozowym w celu frakcjonowania pod względem wielkości i celów wizualizacji. Jednoetapowy i dwuetapowy RT-PCR pokazano na rysunku 4.

Rysunek 4: Jednoetapowy i dwuetapowy RT-PCR

Różnica między PCR a RT-PCR

Definicja

PCR: PCR to technika stosowana w biologii molekularnej do amplifikacji segmentu DNA, generująca miliony kopii sekwencji DNA.

RT-PCR: RT-PCR jest wariantem PCR stosowanym w wykrywaniu ekspresji genów w biologii molekularnej.

Kroki

PCR: Denaturacja, hybrydyzacja i wydłużanie to trzy etapy PCR.

RT-PCR: W RT-PCR po odwrotnej transkrypcji następuje PCR.

Szablon

PCR: Dwuniciowa cząsteczka DNA służy jako matryca do PCR.

RT-PCR: Jednoniciowa cząsteczka RNA służy jako matryca do odwrotnej transkrypcji. Jednoniciowa cząsteczka DNA służy jako matryca do PCR.

Używane enzymy

PCR: Polimeraza DNA jest stosowana jako enzym w reakcji PCR.

RT-PCR: Odwrotna transkryptaza i polimeraza DNA są stosowane jako enzymy w RT-PCR.

Podkłady

PCR: W reakcji PCR stosowane są startery przedni i wsteczny.

RT-PCR: Do odwrotnej transkrypcji używa się tylko startera wstecznego, aw reakcji PCR zarówno startera przedniego, jak i odwrotnego.

Wrażliwość

PCR: PCR to czuła metoda.

RT-PCR: RT-PCR jest bardziej czuły niż PCR.

Aplikacje

PCR: PCR stosuje się w funkcjonalnej analizie genów, diagnostyce i monitorowaniu chorób dziedzicznych, klonowaniu DNA, sekwencjonowaniu DNA i amplifikacji dawnego DNA.

RT-PCR: RT-PCR służy do wykrywania ekspresji genów.

Wniosek

PCR i RT-PCR to dwie ważne techniki stosowane w biologii molekularnej. Zarówno PCR, jak i RT-PCR są zautomatyzowanymi technikami zdolnymi do wykładniczego zwiększania liczby kopii docelowej sekwencji DNA, która jest definiowana przez startery do przodu i do tyłu. W PCR jako matrycę stosuje się dwuniciowy DNA. Za pomocą PCR można wykonać klonowanie DNA, sekwencjonowanie DNA i analizę funkcjonalną genów. W RT-PCR ekspresję genów w określonej tkance można zaobserwować poprzez amplifikację RNA. Główna różnica między PCR i RT-PCR polega na ich matrycach stosowanych w każdej reakcji i ich zastosowaniach.

Referencja:

1.”Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR).” Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej. Amerykańska Narodowa Biblioteka Medyczna, b.d. Sieć. Dostępny tutaj. 01 czerwca 2017 r. 2. „Reakcja łańcuchowa polimerazy (lub PCR)”. Klonowanie i analiza molekularna genów. n.p., b.d. Sieć. Dostępny tutaj. 01 czerwca 2017 r. 3. Biolabs, Nowa Anglia. „Synteza CDNA i RT-PCR”. Synteza CDNA i RT-PCR | NEB. n.p., b.d. Sieć. Dostępny tutaj. 01 czerwca 2017 r.

Zdjęcie dzięki uprzejmości:

1.”Reakcja łańcuchowa polimerazy” Autor: Enzoklop - Praca własna (CC BY-SA 3.0) przez Commons Wikimedia 2. „DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis”. Autor: Rainis Venta - Praca własna (CC BY-SA 3.0) przez Commons Wikimedia 3. „Reakcja łańcuchowa polimerazy odwróconej transkrypcji” Autor: Jpark623 - Praca własna (CC BY-SA 3.0) przez Commons Wikimedia 4. „Jeden krok kontra dwa kroki RT-PCR” Autor: Jpark623 - Praca własna (CC BY-SA 3.0) przez Commons Wikimedia